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        內(nèi)蒙古大學基因工程大實驗思考題(范文5篇)

        發(fā)布時間:2022-10-31 14:13:56

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        第一篇:內(nèi)蒙古大學基因工程大實驗思考題

        本科生基因工程實驗

        (記錄及課后思考題)

        姓名: 學號: 專業(yè):

        完成日期:2012年9月9日

        指導老師:

        一、質(zhì)粒DNA的小量制備

        1.影響最終質(zhì)粒產(chǎn)量的主要因素有哪些? ① 與菌的生長狀況有關(guān)

        ② 和提取時的溫度有關(guān),需要低溫 ③ 加溶液Ⅱ、Ⅲ時操作要溫和

        ④ 要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白質(zhì) ⑤ 要用冰乙醇沉淀

        2.提取到的質(zhì)粒純度將直接影響到以后的酶切效果,如何操作才能盡可能的避 免蛋白質(zhì)的污染?

        加入酚:氯仿:異戊醇去除蛋白質(zhì),氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機相的分離。

        二、質(zhì)粒DNA電泳鑒定

        1.泳道的質(zhì)粒DNA有幾條帶?為什么?

        質(zhì)??赡軙谐菪龢?gòu)型,環(huán)狀構(gòu)型和線性構(gòu)型。這三種構(gòu)型中,遷移率最快的應(yīng)該是超螺旋的,其次是線性和環(huán)狀。通常觀察到的是超螺旋和環(huán)狀質(zhì)粒。2.溴酚藍的遷移率相當于多少bp的DNA?

        在0.7%、1%、1.4%、2%的瓊脂糖凝膠電泳中,溴酚藍的遷移率分別與1000bp、600bp、200bp、150bp的雙鏈線性DNA片段大致相同 3.影響本實驗結(jié)果的因素有哪些?

        DNA的長度,結(jié)構(gòu),膠的濃度,電壓等會對實驗結(jié)果造成影響。

        三、質(zhì)粒DNA的酶切

        1.酶切反應(yīng)混合物的體積是否對酶切效果有影響?為什么?

        有影響

        加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影響。大多數(shù)限制酶貯存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃條件下結(jié)冰。2.如何估計DNA用量和酶的用量?

        DNA樣品的濃度(μg / μl):OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000 1U酶切割1ug的質(zhì)粒,酶的量不要超過酶切體系的1/10。3.在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能避免浪費?

        將槍頭不要插入液體很深部位,剛過液面且可以吸取所需的體積的液體。

        四、PCR擴增制備目的基因

        1.復性溫度是根據(jù)什么確定的?

        可以根據(jù)公式:2(A + T)+ 4(C + G),再減5-10度,一般為55℃-60℃ 當50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。

        雙鏈DNA中的G+C的比率越高,則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時間與DNA分子的長度 相關(guān),DNA分子越長,在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子完全分離所需的時間就越長。若變性溫度太低或變性時間太短,則只能使DNA模板中富含 AT 的區(qū)域產(chǎn)生變性,當PCR循環(huán)中的反應(yīng)溫度降低時,部分變性的 DNA 模板又重新結(jié)合成雙鏈 DNA,從而導致PCR的失敗。非特異性條帶數(shù)增多。

        2.引物序列是根據(jù)什么設(shè)計的?為什么要加上酶切位點序列? 根據(jù)cDNA設(shè)計引物,為了更好地與載體連接。3.為什么要在最后延伸10min?

        一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物。

        4.實驗中是否有非特異性擴增產(chǎn)物或引物二聚體帶?如何才能消除?

        ①.重新設(shè)計引物

        ②加大模板用量或減少引物用量 ③擴大反應(yīng)體系

        ④提高退火溫度或Mg離子濃度

        五、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

        1.為何避免用EB染色及用紫外燈照射欲回收的目的DNA?

        紫外照射對DNA有損傷,為了保證DNA的完整性,盡量不用EB染色或紫外照射。

        六、目的基因片段與載體連接

        1.連接酶的最適活性溫度是多少?

        37℃

        2.為什么要采用14℃下連接?

        由于熱穩(wěn)定性較差,因此長時間反應(yīng)時通常需在14°C下進行 3.如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量?

        一般參考T4連接酶的說明書,大多數(shù)人做的是插入片段:載體=3:1至5:1,是分子數(shù)的比值??梢韵葴y出兩者的質(zhì)量濃度(分光光度計或者跑電泳),然后根據(jù)分子量大小可以算出。

        七、感受態(tài)大腸桿菌的制備

        1.制作感受態(tài)菌的過程中,應(yīng)注意哪些關(guān)鍵步驟?

        ①操作是防止污染,這個最容易影響感受態(tài)制作的因素。②懸浮沉淀的過程,一定要輕輕懸浮,最好輕搖懸浮。2.CaCl2溶液的作用是什么?為什么要冰冷的?

        作用:懸浮菌體

        在0~4℃,CaCl2低滲溶液中,細胞膨脹成球狀,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面,較低的溫度也降低了相關(guān)酶的活性較好的保存了DNA,冰浴過程中,原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結(jié)合,在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu),這樣,在42度熱激下,這種液晶結(jié)構(gòu)收縮,將細胞膜扯開孔道,使DNA進入細菌細胞中。

        八、感受態(tài)細菌的轉(zhuǎn)化

        1.影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些? ①細菌的生長狀態(tài):實驗中應(yīng)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生長期的細 胞(一般通過檢測 OD600 來控制。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時細胞密度是 5×107/ml);

        ②所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行;

        ③經(jīng) CaCl2 處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加,24小時達到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的); ④化合物及無機離子的影響:Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子 在(如 Mn2+或 Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000 倍);

        ⑤所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率;

        ⑥質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;⑦一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比; 2.白色菌落出現(xiàn)的原理是什么?

        由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落,因而易于識別。然而,當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。

        九、轉(zhuǎn)化克隆的篩選與鑒定

        1.PCR法篩選的優(yōu)點和缺點是什么?

        酶切法與PCR法PCR可以直接以菌落做模板,比較方便,但有時候有假陽性;酶切鑒定需要提取質(zhì)粒才能酶切,比較費時,且插入片段里不能有所選酶的酶切位點,在片段序列未知時不宜判定,但在序列已知時相對可靠篩選方案哪個更可靠?

        2.酶切法與PCR法篩選方案哪個更靠譜一些?

        酶切法,但是比較費時間 3.最終確認克隆的方法有哪些?

        ①直接篩選:有些載體帶有可辨認的遺傳標記,能有效地將重組分子與本底區(qū)分。

        ②間接篩選:有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標記基因,當外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后,基因失活,抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個抗藥性基因,當外源基因插入到B基因區(qū)后,便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A藥培養(yǎng)基上正常生長而不能在B藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。

        ③核酸雜交:廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上,變性后固定在原位,然后與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。

        ④免疫學方法:如果重組克隆能在宿主菌中表達,就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針,進行原位雜交,選擇特異的克隆。

        十、外源基因的誘導表達

        1.IPTG的作用原理是什么?

        E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?;D(zhuǎn)移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié) 基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結(jié)合,使操縱子(元)受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激 活蛋白(CAP)結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū),三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié),實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表 達 2.為什么要增加抗菌素的用量?

        攜帶載體的菌體在正常情況下,由于自身保護作用,會丟失載體,含有載體的菌體由于代謝負擔過重,比生長速率小于空載菌體!含有載體的菌體在表達外源基因的同時,也能表達AMP分解酶類。此類酶可以分解青霉素,降低危害。不含質(zhì)粒的菌體則無此功能。當菌體接種量很小的時候,不帶質(zhì)粒的菌體生長迅速,很快成為優(yōu)勢菌株,當加入足夠量AMP時,就具有選擇壓力,抑制不帶質(zhì)粒的菌體生長,使得含質(zhì)粒菌體在種群中占有優(yōu)勢。

        十一、SDS-PAGE檢測表達蛋白

        1,影響表達的因素都有哪些?(1)外源基因的拷貝數(shù)(2)外源基因的表達效率

        ①啟動子的強弱

        ②核糖體接合位點的有效性

        ③SD序列和起始密碼ATG的間距

        ④密碼子組成

        (3)表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性(4)細胞代謝負荷(5)工程菌的培養(yǎng)條件

        2,如何確定凝膠上的某條蛋白質(zhì)帶就是所要表達的外源基因產(chǎn)物?

        電泳檢測時,加個空白的大腸桿菌蛋白做對照,根據(jù)已知的目的蛋白的大小,再加個蛋白,進行對比,一般來說誘導出來的蛋白濃度明顯會高于其他蛋白的.3,pET-his載體為什么必須在BL21(DE3)菌,而不能在DH5α中表達?

        大腸桿菌DH5α一般做克隆或保存質(zhì)粒用,BL21用來做原核表達用。BL21(DE3)菌株用于高效表達含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如pET系列)的基因,表達效率高。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ 噬菌體DE3區(qū),該區(qū)整合于BL21的染色體上。DH5α可以表達抗性基因,應(yīng)該也能表達外源基因,但是我們一般不用該菌作為表達菌,可能與表達量、表達產(chǎn)物活性有關(guān)。4,表達產(chǎn)物的形式是包涵體還是可溶性蛋白?如何設(shè)計實驗判定?

        不確定,培養(yǎng)物離心后,加細胞裂解液冷凍,再加PMSF和lysozyme,超聲等方法將細菌破碎,離心,分別收集上清和沉淀,常規(guī)SDS-PAGE進行電泳,即可以鑒定蛋白是可溶性的還是包涵體。

        5,本實驗?zāi)芊衽袛啾磉_產(chǎn)物一定是GFP蛋白?還需要什么方法?

        藍白班篩選,表達GFP蛋白的為白色菌落。6,如何估計表達產(chǎn)物的分子量? 通過粘度估計,一般是用烏氏粘度計測定特性粘數(shù)后折算分子量。

        網(wǎng)址:http://puma08.com/gdwk/1h/1031340.html

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